实验流程：FFPE 组织 RCA¶
版本： v1.0 (2026-01-29)
试剂安全
请在通风橱中使用二甲苯和甲酰胺。
1. 烤片¶
- 56°C 烘烤 16 小时。
2. 脱蜡¶
- 脱蜡剂 (或二甲苯): 2 x 10 分钟。
- 100% 乙醇: 10 分钟。
- 甲醇–乙酸 (3:1): 5 分钟。
- 梯度乙醇: 100% (5 分钟) -> 85% (5 分钟) -> 70% (5 分钟)。
- 水: 3 分钟。
3. RNA 修复¶
- 柠檬酸钠 (0.01 M, pH 6): 在 80°C 孵育 45 分钟。
4. 自发荧光淬灭¶
- 1% 硼氢化钠 (NaBH₄) (溶于 PBS) 孵育 30 分钟。
- 注意：会产生气泡；每 1-2 分钟补充一次溶液。
5. 文库构建¶
(步骤与新鲜冻存类似，但时间延长)
- 消化: 胃蛋白酶 (Pepsin) 37°C 孵育 10 分钟。
- 杂交: 45°C 孵育 120 分钟。
- 连接: 30°C 孵育 2 小时 (使用 SplintR)。
- RCA: 30°C 孵育 12-16 小时。
6. 扩增后处理¶
- 固定: 4% PFA。
- 剥离: 65% 甲酰胺。
- 漂白 (可选): 如果背景过高，使用苏丹黑 B (0.1%) 处理 10 分钟。