实验流程：新鲜冻存组织 RCA¶
版本： v5.3 (2026-01-29)
适用性
样本： 小鼠脑及大多数新鲜冻存组织。
1. 样本制备与切片¶
目标：获得无冰晶、无裂痕的高质量切片。
- 包埋： 使用异戊烷 + 干冰快速冷冻。
- 冷冻切片：
- 刀片温度：-20°C
- 机头温度：-10°C
- 厚度：10 µm
- 贴片： 取预冷载玻片 -> 手背按压升温贴附 -> 立即放回冷台。
- 保存： -80°C。
2. 固定¶
- 复温： 将载玻片立即放置在 37°C 热台 上 1 分钟。
- 固定： 浸入 4% PFA (现配) 中，室温固定 30 分钟。
- 洗涤： PBS 洗涤 2 x 2 分钟。
3. 通透¶
- 孵育： 0.04% 胃蛋白酶 (Pepsin) (溶于 0.1 M HCl) 在 37°C 孵育 2 分钟。
- 洗涤： PBS-Tween 0.05% 洗涤 2 x 2 分钟。
4. 脱水¶
目标：提高组织通透性。
- 80% 乙醇： 10 分钟。
- 100% 乙醇： 2 分钟。
- 复水： PBS-Tween 0.05% 洗涤 2 x 2 分钟。
5. 封闭¶
封闭混合液 (100 µl): * Ampligase Buffer (1X) * KCl (0.05 M) * 甲酰胺 (20%) * Oligo dT (1 µM) * BSA (0.2 mg/ml) & tRNA (0.2 mg/ml) * RiboLock (1 U/µl)
操作： 室温孵育 30 分钟。
6. 杂交¶
条件： * 55°C 15 分钟 -> 45°C 120 分钟。 * 密封反应室 以防蒸发。
洗涤： * 严谨洗涤：10% 甲酰胺 (2X SSC)，45°C 下洗涤 3 x 10 分钟。 * PBS-T 洗涤 2 x 1 分钟。
7. 连接¶
- 酶： SplintR Ligase (2.5 U/µl)。
- 孵育： 37°C 孵育 2 小时 (密封)。
8. 滚环扩增 (RCA)¶
- 酶： Phi29 Polymerase (0.25 U/µl)。
- 孵育： 30°C 过夜 (12-16 小时)。
9. 扩增后固定¶
- 固定： 4% PFA 室温固定 15-30 分钟。
- 剥离： 30°C 下用 65% 甲酰胺洗涤 (3 x 2-10 分钟)。